 |
|
 |
|
Tudor Adriana
Junior
Data inscrierii: 01/Oct/2008
Mesaje: 7
Localitate: Timisoara
|
|
 |
|
 |
|
 Trimis: 05/10/2008 19:25 Titlul subiectului: Resveratrolul |
 |
|
1. Introducere
Flavonoidele, un grup de compusi cristalini aflati in plante, au fost descoperite, in 1936, de catre Albert Szent Gyorgyi, laureat al Premiului Nobel. El Ie-a denumit mai tarziu vitamina P. Inca de la descoperirea lui, oamenii de stiinta au izolat mai mult de 4000 de flavonoide. Totusi, chiar acest numar mare poate reprezenta numai o mica parte din flavonoidele care exista in natura. Aceste substante sunt responsabile de colorație inchisa ale murelor; se mai gasesc in coaja citricelor si a altor fructe, legume, nuci, seminte, cereale, legume, ceai, cafea, cacao si in vin. In plus, majoritatea plantelor medicinale isi datoreaza calitatile terapeutice acestor flavonoide.
Flavonoidele sunt numite uneori bioflavonoide, un termen adesea folosit pentru a descrie flavonoidele active din punct de vedere biologic. Cand cumparati vitamine care contin flavonoide, veti constata ca termenul bioflavonoide este cel mai adesea folosit. Termenii sunt in general echivalenti.
Dintre miile de compusi cu acest nume ciudat, flavonoidele care au fost cel mai studiate sunt quercetina, rutina, naringina, hesperdina, geniteina, baicalina, Picnogenolul (un produs care combina mai multe substante), catechina si complexul bioflavonoid. Nu e nici o indoiala ca vom afla mai multe despre acesti compusi remarcabili pe masura ce cercetarile continua.
De curand, flavonoidelor li s-a acordat o mare atentie datorita proprietatilor lor antioxidative impresionante. Cativa dintre acesti compusi par sa fie mai eficienti decat antioxidantii obisnuiti - vitaminele C si E pentru ocazie - prin efectul lor, cum ar fi protejarea de oxidare a lipoproteinelor de joasa densitate (LDL). Si rezulta ca, daca noi am manca o multime de fructe, legume si cereale, consumul de flavonoide ar depasi consumul de alti antioxidanti cum ar fi vitamina C. De fapt, consumul de flavonoide este estimat a fi intre 200 si 1000 mg pe zi.
Dar contributia lor la sanatate merge dincolo de proprietatile lor antioxidative. Sute de studii asupra flavonoidelor au demonstrat ca aceste substante au un domeniu larg de capabilitati. Ele pot de asemenea sa scada nivelul colesterolului, oferind protectie mai departe impotriva bolilor cardiovasculare. Poseda calitati antivirale anticanceroase, antiinflamatorii, antihistaminice si pot fi utile in prevenire si/sau tratarea unei varietati de boli. Cercetarile intaresc aceasta teorie.
De exemplu, mai multe studii - in special acelea ale doctorului C. Kandaswani si doctorului E. Middleton - au demonstrat eficienta unor flavonoide in prevenirea si tratarea diferitelor tipare de cancer. Aceste studii care includ tratamente ale cancerului rezistent la chimioterapie au implicat atat liniile celulare (culturile de celule facute in vase Petri), cat si organismul viu.
In anul 2002, intr-un studiu pe 10 000 de finlandezi - barbati si prietene - cercetatorii au descoperit mai multe asociatii specifice intre cateva flavonoide din dieta si cateva boli cronice. Ei au constatat ca persoanele care iau quercetina in cantitate mare au o mortalitate mai scazuta la cardiopatie ischemica, persoanele care iau hesperetina kaempferol si naringenina au un o incidenta mai scazuta la accidentele vasculare cerebrale; barbatii care iau quercetina au o incidenta mai scazuta la cancerul de plamani; barbatii care iau mai multa miricetina au un risc mai scazut la cancerul de prostata; cei care iau o cantitate mai mare de quercetina, naringina si hesperetina au o incidenta mai mica de astma, o doza mai mare de quercetina si de miricetin este asociata cu o reducere a riscului de diabet de tip 2.
S-au facut multiple cercetari aspra activitatii antivirale a flavonoidelor, in distinct asupra virusilor asociati cu poliomielita, gripa, hepatita de tip A si B, herpes simplex 1, virusului de tip 1 responsabil de leucemia celulelor T umane si HIV (SIDA), virusul imunodeficintei umane. In vitro, in conditii de laborator, de exemplu, baicalina si quercetina au dovedit ca inhiba multiplicarea virusului SIDA in procent de 100%.
Este interesant de notat ca multe plante medicinale folosite de-a lungul secolelor contin un indice inalt de flavonoide. Un exemplu poate fi gasit in medicina japoneza, planta denumita Sho-saiko-to care este folosita in tratarea bolilor cronice de ficat. Cand cercetatorii au examinat proprietatile acestor plante de a inhiba cresterea celulelor canceroase ei au descoperit ca folosirea ierburilor combinate a inhibat mai bine cancerul decat daca aceste ierburi ar fi actionat individual. Aceasta demonstreaza clar efectul sinergie al flavonoidelor.
Flavonoidele care se comporta ca fitoestrogenii nu sporesc nivelurile de estrogen, asa cum ar implica numele. Dimpotriva, ele incurajeaza un echilibru mai bun al estrogenului pozitiv fata de al estrogenului negativ, ajutand corpul sa metabolizeze estrogenul negativ. Un estrogen negativ (estradiol) in exces este implicat in cancerul de san, cancerul de prostata, simptomele de menopauza, simptomele sindromului premenstrual, endometrioza, formatiunile fibrochistice din san, si alte tulburari hormonale posibile. Flavonoidele ajuta trupul sa converteasca estradiolul in estriol, forma protectoare si sigura a estrogenului. De fapt, estriolul este forma preferata de estrogen folosita in Europa in terapia de substitutie hormonala. Surse bogate de fitoestrogen sunt in produsele de soia si acesta poate fi unul dintre motivele pentru care in tarile estice s-a gasit o incidenta scazuta a tulburarilor dependentei de estrogen, caci acest aliment este mai prezent in regimul alimentar obisnuit.
Exista de întocmai rapoarte despre folosirea flavonoidelor in tratamentul osteoporozei ca o alternativa sigura a terapiei de substitutie a estrogenului.
Tinand seama de sutele de studii care au fost efectuate pe flavonoide si de faptul ca multe alte consecințe au fost observate cand au fost comparate cu studiile efectuate pe medicamente, este de remarcat ca aceste substante nu sunt cu mult mai frecvente ca optiune de remediu pentru SIDA, artrite, hepatite, boli cardiovasculare si alte maladii degenerative care au raspuns in conditii de laborator, in experimente pe animale si oameni.
Fitoalexina resveratrol s-a descoperit pentru prima data in pielita bobului de strugure si mai apoi in vin. Cercetarea continutului de resveratrol din vin s-a datorat interesului impotriva cancerului si a bolilor de inima prin ingerarea agentilor chimici pentru a atenuează riscul cancerogenezei. Resveratrolul inhiba evenimentele celualare asociate cu declansarea tumoriilor si avansarea acestora. Compusul functioneaza de asemenea ca si un antimutagen si are proprietati contra fungiilor.
S-au realizat numeroase studii asupra cantitatii de resveratrol din vinurile de masa. Tehnicile HPLC (high Performance Liquid Chromatography) sunt cele mai des folosite metode, dar si cromatograficã cu gaz, GC-MS, si electroforeza zonei capilare (CZE) s-a propus.
Resveratrolul exista sub 3 forme izomere care pot avea cantitati variabile in vinurile comerciale. Izomerul trans- este transformat in izomerul cis- sub actiunea luminii UV. Activitatea fiziologica a aspectului cis- nu s-a studiat anterior, deci este important sa il deosebim de izomerul trans- sis a il cuantificam separat.
Metodele de analiza a izomerului cis- sunt mai putin numeroase, desi numeroase tehnici HPLC au ajuns disponibile. Problema acestu isomer este lipsa unui standard potrivit. Singura procedura publicata pentru a sintetiza resveratrolul a fost cea a izomerului trans ca si produs finit principal si este singurul izomer la dispoziție la momentul present (1999). Am așezat metode asemanatoare celor raportate anterior pentru a depasi limitele si pentru a propune întâia metoda CZE pentru a analiza ambii izomeri in acelasi timp.
Determinarea cis-resveratrolului si trans-resveratrolului in vin, in general necesita utilizarea unor tehnici de extractie si preconcentrare inainte de CZE, pentru a simplifica electroferogramele. Acest lucru deoarece acei compusi sunt prezenti in vin in concentratii cumplit de scazute si matricea vinurilor este foarte complexa. In primul rand, procedura de extractie lichid lichid s-a propus pentru prepararea probei. Mai recent, exctractia fazei fluide s-a fixat pentru a separa trans resveratrolul si alti compusi fenolici folosind in de frunte solventi ca methanol si acetat de etil pentru a eluta aceste analize din coloane C18.
In aceasta lucrare, noi propunem o metoda rapida CZE pentru a determina cis- si trans resveratrolul. Am folosit, inainte de separarea electroforetica, un cartus C18 pentru exctractia si preconcentrarea acestor compusi din vin. Metoda propusa este mai simpla si mai rapida decat aceea descrisa de metodele HPLC folosite anterior pentru a determina cis- si trans- resveratrolul.
2. Generalitati
Resveratrol este o fitoalexina, din o clasa de antibiotici produsa de o parte din plante ca mijloc de aparare impotriva infectiei.
Resveratrol (3,5, 4 I trihidroxistilben) un fitoalexin polifenolic. Este un stilbenoid, derivat al stilbenului si este produs de vegetale cu susținerea sintezei enzimei stilbene. Exista sub doi izomeri: cis-(Z) si trans- (E). Izomerul trans poate suferi o izomerizare in forma cis- atunci cand este incalzit sau expus la iradieri ultraviolete.
In anul 2004 Dr. Sinclaire de la Universitatea Harvard a spus ca molecula de resveratrol este extrem usor oxidabila. S-a spus ca este numaidecât distrusa la expunerea la lumina, caldura si oxigen.
Totusi, studiile au aratat ca trans- resveratrol poate suporta o oxidare usoara, la o atmosfera normala si temperatura camerei.
3. Proprietati:
• Puncte de topire: 265-266 grade Celsius
• Solubilitate in apa: mai mare de 100μg/ml la 25 grade Celsius
• Formula chimica C14H12O3
• Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis
• Solubilitate in etanol: 50g/l
• Masa molara: 228,25
• Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc
• Scade nivelul colesterolului plenar din sange
• Combate osteoporoza
• Administrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce prelungeste viata cu 70-80%.
4. Surse:
• Resveratrol se gaseste in struguri, vin, must de struguri, fructe afine din specia (Vaccinum), mure, si merisorul (cranberrie)
• Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi
Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare:
• Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol
• Vinul rosu contine mai mult resveratrol
VIN TOTAL RESVERATROL (mg/l)
Alb 0,05-1,80
Rose 0,43-3,52
Rosu 1,92-12,59
Must de struguri 1,14-8,69
ALIMENTE INTEGRAL RESVERATROL (mg)
Alune americane 0,01-0,26/146g
Alone americane fierte 0,32-1,28/180g
Unt de alone 0,04-0,13/258g
Struguri rosii 0,24-1,25/160g
Experimentele Univeritatii Harvard apartinand lui David Sinclaire a publicat in 2003 in publicatia “Nature” au demostrat ca resveratrolul mareste semnificativ viata drojdiei Saccharomyces cerivisiae. Dr. Sinclaire a fondat mai apoi Sirtris Pharmaceutical pentru a comercialiya resveratrolul sau alti componenti asemanatori ca si medicament împotriva imbatranirii. Mai tarziu studiile au aratat ca resveratrolul prelungeste viata viermelui Caenorhabditis elegans si a Drosophilei melanogaster.
5. Beneficii:
Examinând, prin experimente de laborator pe culturi celulare modul în care beta-amiloidul, proteina care se depune în creierul bolnavilor cu Alzheimer, omoară neuronii, cercetătorii de la Institutul de Boli Neurologice Gladstone au observat că această acţiune distructivă a amiloidului poate fi prevenită cu resveratrol, un component natural al vinului roşu, aflăm din Journal of Biological Chemistry. „Rezultatele studiului nostru sugerează că resveratrol (o substanţă din grupa fito-alexinelor, fabricată de înspre anumite plante ca răspuns la injuriile provocate de microorganisme, în special fungi, despre care se ştie că scade riscul bolilor cardiovasculare şi a cancerelor) poate preveni pierederea neuronală asociată bolii Alzheimer”, spune întâiul autor, prof. dr. Li Gan, cercetător principal la Institutul Gladstone. Datele noastre, cu siguranţă, sunt deschizătoare de drumuri spre noi terapii în această boală invalidantă.”
Potrivit echipei de cercetători, cel mai interesant era faptul că substanţa mai sus amintită, resveratrolul, nu avea un impact direct asupra amiloidului sau asupra neuronilor, ci şi-a exercitat efectul prin acţiunea sa asupra microgliei.
Microglia, celula imună proprie creierului, poate proteja sau ataca neuronii în funcţie de mecanismul său care se activează, cel de apărare sau de atac. Cercetătorii au descoperit că beta-amiloidul distruge neuronii de fapt prin intermediul microgliei, adică joacă rolul de trigger în declanşarea mecanismului de atac asupra neuronilor, prin intermediul mediatorului denumit proteina NF-Kb, care se activează în microglie, transformând-o, practic, într-o „maşină” de ucis neuronii. Se pare că resveratrolul îşi exercită efectul protectiv prin blocarea acestei proteine NF-Kb, împiedicând astfel microglia să distrugă neuronii.
Resveratrolul se găseşte în mod natural în struguri, fragi, alune şi în unic în vinul roşu.
Testele efectuate in laborator pe cobai obezi au indicat faptul ca resveratrolul are urmări benefice asupra sanatatii si creste foarte mult speranta de viata.
Resveratrolul este un polifenol ce se gaseste din abundenta in struguri, fructe de padure si alune. Resveratrolul este prezent cu 50 pina la 100 de miligrame in fiecare gram de pielita de strugure, mai mult decit dublu fata de concentratia existenta in oricare alte fructe. Vinul rosu, care este fermentat mai mult timp impreuna cu pielita si coditele boabelor de strugure, contine o cantitate ridicata de resveratrol in compozitia sa.
Aceasta molecula, devenita celebra datorita "paradoxului frantuzesc" (consumul de vin rosu) ar putea explica de ce francezii sufera de mai putine maladii cardiovasculare, in ciuda alimentatiei bogate in calorii.
Teste anterioare au demonstrat efectul binefăcător al acestei molecule asupra viermilor, musculitelor si a drojdiei.
Insa acest studiu pe cobai, publicat in ultimul numar al revistei britanice Nature, este primul care demonstreaza ca resveratrolul are efecte asupra mamiferelor, spun cercetatorii de la scoala de medicina a Universitatii Harvard (HMS), Massachusetts, si de la Institutul national american de studii gerontologice (NIA).
"Este pentru prima data cind se demonstreaza ca molecula resveratrol are efecte pozitive pentru prelungirea vietii mamiferelor", a declarat David Sinclair, coordonator al acestui studiu.
"Cobaii au o structura mai apropiata oamenilor decit celelalte organisme cercetate pina acum, ceea ce ne da speranta ca aceasta molecula poate actiona in mod similar asupra oamenilor fara efecte adverse nefaste", a adaugat cercetatorul.
"Dupa sase luni, resveratrol a impiedicat toate evolutiile negative ale unui regim alimentar foarte bogat in calorii asupra organismului", a subliniat Rafael de Cabo, co-autor al acestui studiu. Cobaii obezi nu au dezvoltat diabet si si-au mentinut sanatatea ficatului si a sistemului cardiovascular.
Studii recente au demonstrat ca resveratrolul poate restrânge creșterea melanomului de piele, poate distruge cancerul la sin si poate micsora nivelul colesterolului.
6. Determinari experimentale
a) Determinarea resveratrolului din alone folosind LC-TOFMS
Introducere
Resveratrol este un antioxidant primar ce apare in mod natural in diverse plante cum ar fi: alune, struguri, etc.
Resveratrolul, știut ca fiind si 3,4’,5-trihidroxistilen si 3,4’.5-stilbentriol, exista sub forma de izomeri cis si trans. In alune se gaseste izomerul trans, continutul in acesta variind intre 20 si 1000 de nanograme/gram de alune.
Nutritionistii privesc resveratrolul ca si un potential compus anticancerigen si cardioprotectiv. Compusul este crezut a fi partial responsabil de efectele de diminuare a colesterolului datorita consumului de vin rosu.
Multe proceduri de analiza au aparut pentru a studia acest compus. Multe dintre aceste metode se bazeaza pe detectarea cu ajutorul metodelor HPLC si absorbtie UV. In unele cazuri pentru a studia compozitia este necesar sa se afle si variabilitatea componentei fenolice, căci cuantificarea este scopul final in cele mai multe cazuri. Pentru asemenea aplicatii, Spectrofotometria de masa a timpului de tranzit (TOFMS) a devenit metoda aleasa.
In acest studiu, metoda LC-TOFMS este aleasa pentru a determina trans-resveratrolul din alune. Prin folosirea algortimului de gasire automata a varfului cu ajutorul software-ului ChromaTOF, combinat cu LECO Unique LC-TOMFS, un obiect de analizat cum este trans resveratrolul din alune se poate gasi si cuantifica. Curbele de calibrare s-au realizat pentru a obtine rezultate de baza asupra cantitatii de produs de analizat.
Conditii experimentale
Prepararea probelor:
1. Aluna bruta
Se cantaresc 10g intr-un tub de sticla
Se adauga 10ml de etanol80% in apa si capsula
Se agita timp de 1 minute si mai apoi se pune sub presiune Sonora timp de 30 de minute
Se pune la cetrifuga timp de 30 de minute la 3000 rpm(rotatii pe minut).
Se conditioneaza o coloana C18 SPE cu 1 ml metanol si 1 ml apa.
Se incarca 5 ml de supernatant intr-o coloana si se lasa sa curga prin aceasta datorita gravitatii.
Se spala cu 4 ml de methanol 5% in apa, se usuca in vid timp de 30 de minute si se arunca toti eluantii adunati pana acum.
Se face elutie cu 4 ml etanol
Se usuca sub nitrogen la 400C
Se adduce la volumul final de 200μL cu 10% etanol in apa.
2. Proteina din alune izolata
Se cantaresc 10 grame de praf de proteina din aluna intr-un tub de centrifugare de 50ml
Se adauga 35ml de etanol 100% si capsula
Se agita timp de 1 minut si apoi se supune la presiuni sonice timp de 60 de minute.
Se pune la centrifuga pentru 30 de minute la 3000 rpm.
Se transfera supernatantul intr-o sticla sub forma de para si se evapora rotativ
Se adauga 2ml apa in sticla
Se supune presiunilor sonice pentru a se dizolva si transfera intr-un extractor mixor.
Se spala sticla cu 5 ml de acetat de etil si se pune in extractor
Se extrage si se lasa partitiile
Se conditioneaza o coloana de siliciu Sep-Pak cu 6 ml acetate de etil.
Se adauga un înveliș superior din extractorsi se lasa sa curga prin gravitatie.
Se ridica coloana cu 5 ml de hexan, se usuca sub vin timp de 30 de secunde si se arunca toti elutantii adunati pana acum
Se eluta cu 6l de 3:2 acetat de etil/benzen
Se usuca sub nitrogen la 400C
Se aduce la volum finla de 200μL cu metanol
3. Instrumente
LC: Agilent 1100
Coloana: Phenomenex Luna C18, 2.1x100mm, 3μm
Temperature coloanei: 350C
Rata de curgere: 150μL/minut
Volumul de injectie: 10μL
Faza mobila: 0.1% acid formic in apa/acetate nitrit (60/40)
MS: Unique TOMFS
Sursa: High Flow ESI (ESI de mare debit)
Voltajul ESI: 3200V
Duza de comanda: 160V
Racleta: 62V
Presiunea de injectie: 325kPa
Desolvatarea gazului (N2): 7L/minut
Temperatura de desolvatare: 3100C
Temperatura de interfata: 1000C
Rata de colectare a datelor: 1.5 spectru/secunda
Calibrarea masei: 3 puncte externe (sulfamida,m/z 173.038; hidroxiprogesteron, m/z 331.227; MRFA, m/z 524.265)
4. Rezultate
Analiza cantitativa a resveratrolului intr-o proba de alune bruta
Curba de calibrare pentru resveratrol a fost preparata din injectii triple (10ml) de 6 concentratii: 1.008ng/l, 2.016ng/l, 5.040ng/l, 10.08ng/l, 20.16ng/l si 50.40 ng/l. Acesta a fost intervalul asteptat pentru probele testate. Liniaritatea s-a observat in acest interval cu un coefficient de corelare de 0.998.
O proba de alune bruta a fost analizata in mai putin de 5 minute si procesata in comparative cu curba de calibrare de mai sus pentru a cuntifica resveratrolul. Aceasta cromatograma si tabelul de cuantificare pentru proba de alune brute sunt aratate in figura de mai jos.
ChromaTOF software s-a întrebuințat pentru a cuantifica automat resveratrolul. Concentratia resveratrolului intr-o proba de alune bruta s-a determinat ca fiind de 94ng/g.
S-a analizat, de asemenea, o proba de proteina de alune in mai putin de 5 minute si s-a procesat in comparative cu curba de calibrare care s-a stabilit ca, cuantifica resveratrolul. Cromatograma si tabelul de cuantificare pentru proba izolata de proteina din alune se arata in figura de mai jos. ChromaTOF software s-a folosit pentru a cunatifica automat resveratrolul. Concentratia de resveratrol intr-o proba izolata de proteina bruta s-a gasind ca fiind de 246ng/g.
Analiza de recuperare a resveratrolului
O proba de faina de grau a fost preparata in acelasi mod ca si proba de aluna bruta si s-a folosit ca si matrice goala. Faina de grau s-a ales datorita asemanarii compozitiei matricei. O cantitate de proba de 100μL de faina de grau s-a adaugat 100μL din 100.8 ng/μL resveratrol standard si diluat la 1 ml cu apa. Figura de mai jos ne arata cromatograma resveratrolului cu faina de grau. Masele exacte a resveratrolului s-au comparat cu resveratrolul asteptat m/z = 229.0859. recuperarea resveratrolului este aratata in tabelul de mai jos si s-a determinat a fi 102% (n=3)
Table 1. Resveratrol recovery in a wheat flour sample
Nr. Nume R.T. (min:sec) R.T. asteptat (min:sec) Interval Raspuns (ng/μL)
1.
Resveratrol
03:24.5
03:10.7
3585.3
10.2
2.
Resveratrol
03:24.5
03:10.7
3595.6
10.3
3.
Resveratrol
03:24.5
03:10.7
3599.7
10.3
Concentratia medie 10.3
Concentratia asteptata 10.1
% Recuperare 102
b) Determinarea simultana a cis- si trans- resveratrol din vin prin electroforeza zonei capilare
Reactivi
Solventii organici au fost de gradul HPLC (methanol si acetonitril, Sharlau, Barcelona, Spania). Apa Milli-Q (Millipore, Watford, Hetrs.,UK) se folosesc pe parcursul studiului.
Trans- resveratrolul a fost procurat din Sigma (St. Louis, MO, USA).
Solutia standard de materie prima de 250mg/L s-a preparat in acetonitril si se depoziteaza la intuneric. Cis- resveratrol s-a preparat din izomerul trans utilizând radiatii UV. Solutiile standard de lucru au fost preparate prin dilutii solutiei de materie prima standard cu apa purificata sau vin.
100mM de solutie tampn de materie prima tetraborat de sodium s-a folosit ca si electrolit de fond. O solutie de hidroxid de sodiu 0.1M s-a folosit pentru conditionarea capilaritatii. Exctractia izomerului trans s-a realizat intr-un cartus cu faza inverse C18 (Whaters Sep-Pak, Milford, MA, USA). Cartusul a fost reconditionat inainte de a fi folosit cu ajutorul a 5 ml de methanol urmata de 5 ml de solutie tampon, pH = 7.00 (fosfat de potasiu monobasic-fosfat de potasiu dibazic)
Aparatura
Beckman (Fullerton, CA, USA)
Sistem de electroforeza capilara P/ACE 5510 echipat cu detector cu dioda UV/VIS a analizei si controlata de DELL DIMENSION P133V cu statie software P/ACE.
Separarea s-a creat folosind capilare de gel de siliciu (25cmx75μm) mentinute intr-un cartus cu o fereastar de detectie de 100x800μm.
Conditii de operare
Capilarul a fost conditionat inainte de prima exploatare prin spalare cu 0.1m NaOH timp de 10 minute mai apoi timp de 5 minute cu apa si in final cu o solutie de electrolit timp de 5 minute.
Tamponul folosit a fost 40mM tetraborat de sodiu (pH = 9.5) cu un voltaj de 5kv, curentul mediu de 40μA si la temperature de 250C. Probele au fost injectate cu injectii hidrodinamic timp de 5 secunde. Electroferogramele au fost inregistrate la 320nm.
Capilarul a fost spalat intre doua separari cu NaOH 0.1M (1 minut), apa ultrapura (1 minut) si tampon proaspat (2 minute).
Injectiile duplicate ale solutiei au fost fabricate si corectate media intervalului de varf (interval/timpul de migrare) au fost folosite pentru cuantificare.
Prepararea probei
Vinul (25ml) a fost turnat intr-un pahar de laborator si neutralizat la un pH 7.00 cu ajutorul NaOH. Cartusul a fost mai apoi usor umplut cu vinul neutralizat.Apoi, cartusul a fost spalat cu 2ml apa, 2 ml solutie tampon, pH 7.00 si 4ml acetonitril: apa (1+9). Cis- si trans- resveratrol au foat apoi eluate cu 4 ml acetonitril:apa (3+7). Cartusul a fost apoi spalat cu 5 ml methanol si 5 ml solutie tampon.
Rezultate si discutii
Optimizarea procedurii electroforetice
Efectul pH-ului electrolit.
pH-ul al electrolitului functional a avut un effect semnificativ asupra ionizarii acidului silanoil al peretelui capilar si asupra mobilitatii electroforeticeale izomerilor studiati. Intervalul pH-ului 7.00-10.70 a fost ales pentru progresul metodei de separare a cis- si trans- resveratrolului CZE. Pentru a determina valoarea optima a pH-ului, un set de electroliti la diferitele valori ale pH-ului au fost testate. Influenta pH-ului electrolitilor asupra timpilor de migrare a izomerilor studiati este aratata mai jos.
pH-ul de 9.5 s-a selectat ca fiind optim pentru a minimaliza timpul de analiza cu o rezolutie intre puncte.
Efectul puterii ionice a electrolitului.
Puterea ionica optima a electrolitului trebuie sa fie in echilibru intre un current mic acceptabil pentru a minimaliza zgomotul si punct maxim eficient. Efectul concentrarii solutiei tampon de la 10 la 50mM asupra timpului de migrare a izomerile este aratata in figura de mai jos. Dupa cum se poate vedea, cand concentratia solutiei tampon creste creste si timpul de migrare a cis- si trans- resveratrolului. O concentratie de 40mM a tamponului a foat aleasa pentru a mentine o forma buna a varfului si un current slab pentru a minimaliza zgomotul si defectele optice ale liniei de baza.
Efectul voltajului aplicat
Rata de curgere electroosmotica (EOF) si rapiditatea de migrare a izomerilor sunt proportionale cu voltajul aplicat folosit in separare. Introducerea unui voltaj inalt reduce timpul de analiza, dar poate duce la o pierdere semnificativa a rezolutiei si eficientei varfului maxim, fiindcă poate aparea o incalzire excesiva in interiorul capilarului. Alegerea de a opera cu ajutorul unui voltaj poate fi optimizat in conjunctie cu alegerea concentratiei electrolitului, dimensiunilor capilarului si temperatura, pentru a cauzează un nivel de curent acceptabil.
Influenta voltajului aplicat asupra timpului de migrare este arata in figura de mai jos. Dupa cum se astepta, cand creste voltajul de la 3 la 10kV, timpul de migrare a celor doi izomeri de asemenea scad ca si rezolutia dintre varfuri. Astfel, cea mai recenta valoare de 5kV a fost considerate pentru toate studiile datorita bunei rezolutii dintre varfuri si cu valori mari s-au observat curenti mai mari.
Optimizarea etapei de spalare
Este important a se mentine EOF constanta pentru că orice variatie rezulta intro precizie saraca a timpului de migrare. Componentele probei se pot absorbi de suprafata capilara si sa schimbe incarcatura eficienta a peretelui, rezultand intr-o schimbare a EOF.
Pentru a preveni problemele datorate absorbtiei si pentru a asigura o EOF constanta, capilarul este stropit intre injectii cu solutie diluata de NaOH care indeparteaza suprafata superioara a peretelui capilar. S-a folosit o solutie de NaOH 0.1M pentru a ridica capilarul intre cele doua injectii.
Probele au fost analizate urmand timpi de spalare diferiti de la 1 pana la 5 minute. Precizia buna in timpii de migrare s-au observat in acest interval de timp. Timpul de 1 minut s-a ales ca find potrivit timpi de migrare repetabili (zece injectii consecutive).
Dupa spalarea cu NaOH 0.1M, o spalare timp de 2 minute cu un electrolit a fost aleasa pentru prepararea capilarului inainte de a face injectia probei.
Din aceste studii, s-au ales urmatoarele conditii electroforetice:
Electrolit, 40mM Na2B4O7, pH 9.5
voltaj 5kV
capilaritate, siliciu topit (25 x 75 μm)
injectie hidrodinamica, 5s
temperature 250C
detectia semnalului 320nm
Figura de mai jos arata electroferograma ce corespunde standardelor cis- si trans- resveratrol. Din aceasta electroferograma, poate fi determinat ca procedura electroforetica aleasa este excelenta pentru separarea ambilor izomeri. Dupa cum se poate vedea in figura, detereminarea izomerilor cis- si trans- resveratrol din vin este mai rapida metoda aleasa de acest studiu CE decat LC (analiza tipica ce dureaza 6.5 minute in CE si cel putin 10 minute in LC).
7. Bibliografie
http://www.anti-agingsysteme.com/menu/produkt/RESVERATROL.php
http://www.quackwatch.org/01QuackeryRelatedTopics/DSH/
http://lpi.oregonstate.edu/infocenter/phytochemicals/resveratrol
_________________
ing. Adriana Tudor, Timisoara |
|
FAQ 
Mesaje private 
